在理解這篇由著名分子生物學(xué)家George M. Church教授發(fā)表于《科學(xué)》的重磅論文前，我們先了解一下什么是腺相關(guān)病毒（AAV）。AAV是一種單鏈DNA病毒，由科學(xué)家1965年在制備腺病毒時發(fā)現(xiàn)，因此得名腺相關(guān)病毒。腺病毒會感染多種脊椎動物，這其中也包括人類，會誘發(fā)人類的上呼吸道感染，而AAV非常特別，目前的科學(xué)界共識是它不會導(dǎo)致任何人類疾病，也是目前人類發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，正是因為其DNA結(jié)構(gòu)上的缺陷，在沒有輔助病毒的參與下（典型的如腺病毒、單純皰疹病毒等），AAV無法引發(fā)病毒感染。這樣的特性讓AAV成為了科學(xué)家眼中最為理想的基因載體。

未經(jīng)改造的天然存在野生型AAV由蛋白衣殼（capside）和長度為4.7kb的單鏈DNA基因組構(gòu)成。蛋白衣殼由三個亞基組成，分別為VP1，VP2，和VP3。AAV基因組兩端為兩個“T”型的末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeat, ITR）。這兩個ITRs是病毒DNA復(fù)制的起點和觸發(fā)病毒包裝的信號。AAV基因組中的rep基因編碼4個與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，分別為Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

科學(xué)家通過改造AAV，獲得了用于基因療法的優(yōu)良載體——重組腺相關(guān)病毒（rAAV）。rAAV攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎完全相同，然而衣殼內(nèi)的基因組中編碼病毒蛋白的部分完全被刪除，取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因（transgene）。現(xiàn)在，AAV基因組中被保留的部分主要是編碼衣殼蛋白的cap基因，以及ITRs，它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白的部分完全刪除的優(yōu)點是：一方面可以最大化重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面減小體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因時產(chǎn)生的免疫原性和細(xì)胞毒性。但目前的rAAV依然不能滿足基因療法的需求，我們急切的需要一款功能更為強大的AAV，而這次哈佛大學(xué)（Harvard University）著名分子生物學(xué)家George M. Church教授領(lǐng)導(dǎo)研究團隊聯(lián)合Dyno Therapeutics公司（Dyno Therapeutics是一家將人工智能應(yīng)用于基因治療的生物技術(shù)公司）的科學(xué)家，通過結(jié)合計算機技術(shù)，成功得到了一批功能優(yōu)異的AAV。

先前的研究策略集中在對cap基因的優(yōu)化，使其增加遞送效率的同時也就有侵染活性，研究策略限于隨機突變，效果不理想。因此，研究小組對腺相關(guān)病毒2型（AAV2）衣殼中的735個氨基酸位點進行單突變，從而生成了一個包含約200,000個變體的單突變庫。為了研究其功能，研究人員將這些突變體轉(zhuǎn)染到小鼠中，看它們在小鼠不同器官的富集程度。比如，有些突變體特意地在肝臟富集，有些則在血液。這個現(xiàn)象也叫“歸巢”現(xiàn)象。同時，他們通過巧妙的實驗設(shè)計，鑒定了對應(yīng)的衣殼變化，與突變位點的對應(yīng)關(guān)系，建立起了一個計算機模型。

但實際設(shè)計中，單突變可能滿足不了基因療法的需求，要采用多突變位點設(shè)計，同時還要AAV2的活力。為此，他們用計算機模型預(yù)測了多位點突變的一些組合，并與隨機突變組合的進行了比較，最終發(fā)現(xiàn)計算機設(shè)計的突變體，很多既有高的AVV2活力，又保持了其“歸巢”的潛能。令人驚喜的是，研究團隊還發(fā)現(xiàn)了隱藏在衣殼編碼DNA序列中的新輔助蛋白，該蛋白可與靶細(xì)胞膜結(jié)合。

這篇論文構(gòu)建迄今為止最全面的AAV蛋白衣殼庫。Crunch教授表示：“利用這個文庫產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，我們還能夠設(shè)計出更多衣殼突變體，比先前自然或人工變異產(chǎn)生的還要多。不僅如此，AI設(shè)計產(chǎn)生有效衣殼的效率遠遠超過隨機誘變方法產(chǎn)生的AAV?！?

“這些高通量的技術(shù)與計算機技術(shù)相結(jié)合，為未來的基因治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。”Dyno Therapeutics公司現(xiàn)任首席執(zhí)行官，論文共同第一作者Eric Kelsic博士對此表示，過去的方法，如人為設(shè)計或隨機突變，都存在各自的缺點，不是受突變庫規(guī)模限制，就是質(zhì)量低下。機器輔助設(shè)計則是一種數(shù)據(jù)驅(qū)動的蛋白質(zhì)工程方法，另外有足夠數(shù)據(jù)的簡單數(shù)學(xué)模型就可以成功生成可行的合成衣殼。由此借助計算機的力量，便可充分結(jié)合利用上述蛋白質(zhì)工程的迭代和經(jīng)驗方法，從而生成大量高質(zhì)量的衣殼變體?！?

另外，文章作者還發(fā)現(xiàn)，cap基因還能編碼一個新的蛋白MAAP（membrane-associatedaccessory protein）。文章作者推測，MAAP蛋白可能與之前在工程型AVV2庫中發(fā)現(xiàn)的高基因組-衣殼耦合現(xiàn)象有關(guān)。MAAP存在于大部分AAV血清型中，研究人員相信它將在病毒的自然生命周期中發(fā)揮作用。研究人員表示：“研究MAAP的功能是一個令人興奮的領(lǐng)域，并有助于人們更好地理解AAV、并設(shè)計更好地AAV基因療法。該發(fā)現(xiàn)令人鼓舞，但卻只是邁出了第一步。利用這些數(shù)據(jù)和來自未來實驗的數(shù)據(jù)，我們可以構(gòu)建機器學(xué)習(xí)模型來優(yōu)化AAV載體衣殼，并解決各種基因治療的挑戰(zhàn)?！边@項研究可以說是一個里程碑式的進展，更是一個良好的開端。

因此從2015年開始，研究團隊便著力于通過開發(fā)新的機器引導(dǎo)技術(shù)來克服現(xiàn)有技術(shù)局限性，從而在今天宣布研發(fā)出了一種更快速有效的工具型AAV。本項研究具有里程碑式的意義，使用新的高通量測量技術(shù)收集大量數(shù)據(jù)，教他們?nèi)绾螛?gòu)建更好的多位點突變體庫，最終優(yōu)化了AAV的傳遞性能。

研究人員表示：“這只是機器引導(dǎo)的AAV衣殼工程改變基因療法的開始，這項研究的成功使我們看到了追求更多數(shù)據(jù)和更大容量的機器學(xué)習(xí)模型應(yīng)用于基因療法的無限潛力?！?

研究人員的思路是，鑒于觀察到AAV2單突變庫不同突變體在不同器官中富集程度不同，與之相應(yīng)的AAV2有相應(yīng)的突變位點和衣殼結(jié)構(gòu)，研究人員建立計算機模型，將兩者進行聯(lián)系。為了簡化模型，他們選擇了富集在肝臟的那些AAV2突變體，對其一一測序。

為了研究這些突變體在體內(nèi)的作用，研究人員便把AAV2逐一感染到小鼠中，這些感染到小鼠體內(nèi)的突變體有不同生物分布特征，比如分布在腎、心臟、肝、肺等。隨后，研究人員做了主成分分析，將不同AAV2突變體衣殼結(jié)構(gòu)特征與其在生物內(nèi)的分布特征聯(lián)系起來；聚類分析的結(jié)果顯示，有一些突變體特異地被肝清除，而在血液、心臟和腎臟中富集，有些則相反。

圖片來源：參考資料[3]

考慮到之前許多隨機突變產(chǎn)生的AAV2無法進行有效基因傳遞，研究人員也就生出了“能否創(chuàng)造出一種計算機方法來更有效改良AAV2”的想法，為驗證該設(shè)想他們便嘗試用計算機進行突變位點設(shè)計。

鑒于AAV2單突變庫不同突變體在不同器官中富集程度不同，與之相應(yīng)的AAV2有相應(yīng)的突變位點和衣殼結(jié)構(gòu)，研究人員建立計算機模型，將兩者進行聯(lián)系。為了簡化模型，他們選擇了富集在肝臟的那些AAV2突變體，對其一一測序，通過測序發(fā)現(xiàn)富集在肝臟區(qū)域的AAV2突變體，其突變位點僅限于cap基因所編碼氨基酸的第561-588位點間，由此他們將此區(qū)域定為多位點突變選擇的靶區(qū)域。

逐個掃描cap基因候選靶區(qū)域的氨基酸位點，計算機模型便會給氨基酸位點按照模型計算出來的可能性進行打分，分?jǐn)?shù)越高，可能性越大。接著研究人員將分值高的位點一起突變，建立起一個多位點突變體庫。

與此同時，他們又根據(jù)氨基酸位點的效果和隨機性的原則，人為挑選了一些氨基酸位點進行突變，作為對照。通過此方法，他們共設(shè)計了1271個AVV2突變體，以及10047個隨機突變體，隨后他們把這些突變體轉(zhuǎn)染到小鼠中，檢測它們的分布情況。最終的結(jié)果顯示計算機設(shè)計的突變體大約有25.6%都是有功能的（即在肝臟中有分布），而近乎一半（4477個）隨機產(chǎn)生的突變體都是無效的（在肝臟中無分布或弱分布）。

這一結(jié)果顯示，計算機設(shè)計具有相當(dāng)高的效率。

參考資料：

[1]Improved AAV Vector Capsid for Gene Therapy Engineered with a NewMachine-Guided Approach Retrieved Nov 29, 2019

from https://www.eurekalert.org/pub_releases/2019-11/tyn-rea112119.php

[2]Harvard Wyss Institute researchers demonstrate machine-guided engineering ofAAV capsids Retrieved Nov 29, 2019 from https://www.eurekalert.org/pub_releases/2019-11/wifb-hwi112219.php

[3]Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enablesmachine-guided design Retrieved Nov 29, 2019 from https://science.sciencemag.org/content/366/6469/1139