基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種和生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。CRISPR/Cas9是由一種原始的細(xì)菌免疫系統(tǒng)改編而成的，它的作用方式是首先在基因組的一個靶位點(diǎn)上切割雙鏈DNA。

圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)

下面讓我們一起來看看，在2019年，科學(xué)家們在基因編輯等基因工程領(lǐng)域取得了哪些重大進(jìn)展。

基因編輯大牛張鋒新力作！發(fā)現(xiàn)第三種CRISPR-Cas系統(tǒng)，顯著降低脫靶效應(yīng)

Nature Communications, 22 January 2019, doi:10.1038/s41467-018-08224-4

在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所的張鋒（Feng Zhang）及其團(tuán)隊著重關(guān)注除Cas9和Cas12a（之前稱為Cpf1）之外的第三種II型蛋白效應(yīng)核酸酶：Cas12b，即一種由兩個gRNA引導(dǎo)的核酸酶，含有單個結(jié)構(gòu)域：RuvC，其中這兩個gRNA為crRNA和tracrRNA。

盡管Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a小，因而從通過病毒載體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)遞送的觀點(diǎn)來看具有吸引力，但是來自嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）的Cas12b核酸酶（AacCas12b）在48°C時表現(xiàn)出最佳的DNA切割活性，這阻止它在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用。張鋒團(tuán)隊試圖鑒定出在較低溫度下有活性的Cas12b家族成員，這樣就可用于人類基因組編輯。相關(guān)研究結(jié)果于2019年1月22日發(fā)表在Nature Communications期刊上，論文標(biāo)題為“Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing”。

圖片來自Nature Communications, doi:10.1038/s41467-018-08224-4

鑒于強(qiáng)效的基因組編輯工具應(yīng)當(dāng)在一系列靶標(biāo)上是高效的和特異性的，張鋒團(tuán)隊在針對293T細(xì)胞中的5個基因的56個靶位點(diǎn)上測試了BhCas12b v4突變體，結(jié)果觀察到強(qiáng)效的DNA切割。接著，他們通過電穿孔技術(shù)將BhCas12b v4-sgRNA復(fù)合物遞送到人CD4+ T細(xì)胞中。在3個測試的靶位點(diǎn)上，這些復(fù)合物表現(xiàn)出的indel發(fā)生率為32%～49%。這些數(shù)據(jù)表明BhCas12b v4突變體在多種基因組編輯環(huán)境下（包括一種在治療上有重大意義的人細(xì)胞類型）可作為一種有效的可編程的核酸酶。

Nature：重磅！首次成功地在哺乳動物中進(jìn)行基因驅(qū)動

Nature, Published online: 23 January 2019, doi:10.1038/s41586-019-0875-2

基因驅(qū)動（gene drive）是一種基因工程技術(shù)，能夠促使后代比正常情形時更頻繁地遺傳來自一個親本的特定等位基因。它已被證實能作用于昆蟲。如今，在一項新的研究中，來自美國加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員發(fā)現(xiàn)它也能夠成功地在脊椎動物中發(fā)揮作用。在這項研究中，他們描述了一種方法，它利用CRISPR-Cas9改變雌性小鼠生殖系細(xì)胞，從而促進(jìn)小鼠后代出現(xiàn)白色毛發(fā)和表達(dá)一種紅色熒光蛋白。相關(guān)研究結(jié)果于2019年1月23日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR–Cas9 in the female mouse germline”。

這是首個證據(jù)表明基因驅(qū)動可在哺乳動物中發(fā)揮效果，但是它并不完美。這些研究人員正在優(yōu)化Cas9在雌性小鼠中產(chǎn)生的時間，并且正在研究更高的效率是否可能解決雄性動物中同源介導(dǎo)修復(fù)的缺乏。

Cell：給Cas9一個開啟開關(guān)，從而更好地控制CRISPR基因編輯

Cell, 10 January 2019, doi:10.1016/j.cell.2018.11.052

在一項新的研究中，來自美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員利用一種稱為循環(huán)排列（circular permutation）的技術(shù)，構(gòu)建出一套稱為Cas9-CP的新型Cas9變體，這將簡化Cas9融合蛋白的設(shè)計，使得它們能夠用于除了簡單的DNA切割之外的多種應(yīng)用，比如堿基編輯和表觀遺傳修飾。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019年1月10日的Cell期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification”。

圖片來自Cell, 2019, doi:10.1016/j.cell.2018.11.052

通過這個相同的過程，David Savage和他的團(tuán)隊將“永遠(yuǎn)開啟（always-on）”的Cas9分子轉(zhuǎn)變?yōu)榭杉せ畹拈_關(guān)。這些開關(guān)保持在“關(guān)閉”位置，直到它們被蛋白酶激活。由此產(chǎn)生的蛋白酶感應(yīng)的Cas9（protease-sensing Cas9, ProCas9）能夠減少脫靶效應(yīng)并實現(xiàn)分子感應(yīng)，以及組織或器官特異性的基因組編輯。他們證實ProCas9可用于檢測病毒蛋白酶，從而潛在地用作一種能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的病原體感應(yīng)系統(tǒng)。

Savage團(tuán)隊使用循環(huán)排列來重新設(shè)計Cas9的分子序列，因而更好地控制它的活性并為融合蛋白構(gòu)建更優(yōu)化的DNA結(jié)合支架。這種Cas9重新連接方法涉及將這種蛋白的末端（即它的氨基端和羧基端）與肽接頭（peptide linker）連接，同時在不同的位置上分割它的序列，從而產(chǎn)生新的相鄰的氨基端和羧基端。

重大進(jìn)展！兩篇Nature Medicine揭示一種新型CRISPR/Cas9療法有望治療早衰癥

Nature Medicine, Published online: 18 February 2019, doi:10.1038/s41591-019-0343-4; doi:10.1038/s41591-018-0338-6

衰老是導(dǎo)致包括心臟病、癌癥和阿爾茨海默病在內(nèi)的許多衰竭性疾病的主要風(fēng)險因素。這使得對抗衰老療法的需求變得更加迫切。如今，在第一項新的研究中，來自美國沙克生物研究所的研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將基因療法遞送到表達(dá)Cas9的早衰癥小鼠模型的細(xì)胞中。在遞送這種基因療法兩個月后，這些小鼠變得更強(qiáng)壯和更活躍，而且它們的心血管健康得到改善。在早衰癥和老年時常見的兩個問題——主動脈血管退化和心動過緩（bradycardia）發(fā)作，在這些小鼠中均表現(xiàn)出減輕或延遲?？傮w而言，這些接受治療的早衰癥小鼠具有與正常小鼠相似的活動水平，而且它們的壽命增加了大約25％。

在第二項新的研究中，西班牙奧維耶多大學(xué)的José M. P. Freije、Carlos López-Otín及其團(tuán)隊開也發(fā)出一種基于CRISPR/Cas9的療法來治療哈欽森-吉爾福德早衰癥綜合征。對這種療法的測試結(jié)果表明，它通過在LMNA基因中引入移碼突變（frameshift mutation）逆轉(zhuǎn)了在哈欽森-吉爾福德早衰癥綜合征小鼠模型和來自患上這種疾病的患者的細(xì)胞中發(fā)生的一些有害變化。

Nat Biotechnol：開發(fā)出更加高效的CRISPR–Cas12a變體

Nature Biotechnology, Published online: 11 February 2019, doi:10.1038/s41587-018-0011-0

在一項新的研究中，來自美國麻省總醫(yī)院、哈佛醫(yī)學(xué)院和麻省理工學(xué)院的研究人員設(shè)計了能夠靶向更廣泛的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的Cas12a變體。

這些研究人員特別報道了一種稱為enAsCas12a的變體，它不需要TTTV 4堿基PAM位點(diǎn)；而野生型AsCas12a需要這種TTTV PAM。與AsCas12a野生型相比，這種變體在典型的TTTV PAM存在時平均具有兩倍高的基因組編輯活性。

它的靶向范圍擴(kuò)大了：增加了七倍。他們進(jìn)一步報道他們成功地將來自enAsCas12a的一部分突變片段移植到AsCas12a上來改善后者的活性。他們聲稱，開發(fā)出的enAsCas12a允許更高效地進(jìn)行多重基因編輯，并提供內(nèi)源性基因激活和C→T堿基編輯。為了降低利用enAsCas12a觀察到的高于正常的脫靶效應(yīng)，他們還設(shè)計了另一種稱為enAsCas12a-HF1的變體。

Nature：科學(xué)家發(fā)現(xiàn)新型的CRISPR基因編輯工具：CasX

Nature, Published online:04 February 2019, doi:10.1038/s41586-019-0908-x

在短短7年時間里，Cas9已經(jīng)成為了在人類、植物、動物和細(xì)菌中能夠被使用的強(qiáng)大基因編輯工具，其能快速并準(zhǔn)確地切割和拼接DNA，其也有望幫助開發(fā)治療多種人類疾病的新型療法。日前，一項刊登在國際雜志Nature上的研究報告中，來自加州大學(xué)伯克利分校的科學(xué)家們通過研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的小型CRISPR基因編輯工具：CasX，其與蛋白Cas9較為相似，但比Cas9小很多。

實際上，CasX是細(xì)菌和人類細(xì)胞中潛在的一種有效基因編輯工具，其似乎是在細(xì)菌中進(jìn)化出的獨(dú)立于其它Cas蛋白的一種特殊蛋白，CasX能夠切割雙鏈DNA，結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，同時還能靶向作用特殊的DNA序列。由于CasX來自于細(xì)菌細(xì)胞中，因此相比Cas9而言，人類機(jī)體免疫系統(tǒng)或許能夠更加容易地接納CasX。

我國科學(xué)家在兩篇Science論文上揭示胞嘧啶堿基編輯器誘導(dǎo)大量的脫靶突變

Science, Published online:28 February 2019, doi:10.1126/science.aaw7166; doi:10.1126/science.aav9973

在第一項新的研究中，中國科學(xué)院的李亦學(xué)（Yixue Li）課題組、楊輝（Hui Yang）課題組和美國斯坦福大學(xué)的Lars M. Steinmetz課題組開發(fā)出一種稱為GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection）的方法來評估三種經(jīng)常使用的基因編輯工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶堿基編輯器3（BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤堿基編輯器7.10（ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）---誘導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。

他們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過BE3編輯的細(xì)胞中鑒定出的90%以上的單核苷酸變異（SNV）是G>A或C>T，這一突變偏好并沒有在經(jīng)過Cre、Cas9或ABE7.10處理的細(xì)胞中觀察到。這一突變偏好與APOBEC1本身的突變偏好相同，這表明這些突變并不是自發(fā)的而是由BE3編輯誘導(dǎo)的。

在第二項新的研究中，中國科學(xué)院的高彩霞（Caixia Gao）課題組通過對作為一種重要的作物物種的水稻進(jìn)行全基因組測序?qū)Π奏A基編輯器（BE3和HF1-BE3）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）產(chǎn)生的脫靶突變進(jìn)行全面調(diào)查。他們發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器（BE3和HF1-BE3）誘導(dǎo)全基因組脫靶突變。這些脫靶突變主要是C>T單核苷酸變異，在轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域中富集，通過當(dāng)前的計算機(jī)方法是無法預(yù)測的。

Nature子刊：當(dāng)心！DNA扭曲增加CRISPR-Cas9脫靶編輯風(fēng)險

Nature Structural and Molecular Biology, March 2019, doi: doi:10.1038/s41594-019-0188-z

在一項新的研究中，來自英國帝國理工學(xué)院和阿斯利康公司的研究人員指出當(dāng)使用CRISPR-Cas9時，在基因表達(dá)和其他細(xì)胞過程中經(jīng)常發(fā)生的DNA扭曲可能導(dǎo)致基因組脫靶變化。這些研究結(jié)果可能有助于為在臨床應(yīng)用上提高基因編輯準(zhǔn)確性鋪平道路。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在 2019年3月的Nature Structural and Molecular Biology期刊上，論文標(biāo)題為“DNA stretching induces Cas9 off-target activity”。

CRISPR-Cas9是一種允許人們發(fā)現(xiàn)和編輯DNA鏈的基因編輯工具。隨著科學(xué)家們在醫(yī)學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域使用CRISPR-Cas9，它因它的多種用途獲得了全球的認(rèn)可。在這項新的研究中，CRISPR-Cas9的準(zhǔn)確度和精確度是通過一種新的方法進(jìn)行研究的：使用光學(xué)鑷 子---一種使用激光束操縱DNA的工具---模擬DNA自然經(jīng)歷的扭曲，就像是細(xì)胞的分子機(jī)器讀取了它。

他們隨后利用CRISPR-Cas9編輯基因并使用熒光顯微鏡監(jiān)測它的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，當(dāng)DNA松散和松弛時，CRISPR是準(zhǔn)確的，但是當(dāng)DNA發(fā)生扭曲---在這種情況下，DNA遭受 高度拉伸---時，CRISPR編輯準(zhǔn)確性降低，并且觀察到脫靶編輯。了解這種效應(yīng)將有助于設(shè)計具有更高準(zhǔn)確度的CRISPR系統(tǒng)，以及評估這種風(fēng)險的方法。

Nature：開發(fā)出Cas9-MMEJ可編程基因編輯方法，有望治療143種由DNA微重復(fù)引起的疾病

Nature, Published online:03 April 2019, doi:10.1038/s41586-019-1076-8

在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)出一種利用CRISPR-Cas9和一種很少使用的DNA修復(fù)途徑編輯和修復(fù)一種特定類型的與微重復(fù)（microduplication）相關(guān)的基因突變。這種可編程基因編輯方法克服了之前在基因校正中所遭遇的低效率。

微重復(fù)是染色體發(fā)生變化而使得 DNA上的小片段被拷貝或復(fù)制。在某些基因中，當(dāng)添加的核苷酸數(shù)量不能被3整除時，這些微重復(fù)就能夠?qū)е滤^的“移碼突變”。這改變了基因向蛋白的翻譯，從而導(dǎo)致功能喪失。由微重復(fù)引起的移碼突變導(dǎo)致多達(dá)143種不同的疾病，包 括肢帶肌營養(yǎng)不良（limb-girdle muscular dystrophy）、赫曼斯基-普德拉克綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome）和家族黑蒙性白癡?。═ay-Sachs）。

Nature：震驚！CRISPR堿基編輯器能夠誘導(dǎo)大量的脫靶RNA編輯

Nature, Published online:17 April 2019, doi:10.1038/s41586-019-1161-z

在一項新的研究中，來自美國麻省總醫(yī)院、哈佛醫(yī)學(xué)院和哈佛大學(xué)陳曾熙公共衛(wèi)生學(xué)院的研究人員報道近期開發(fā)的幾種在單個DNA堿基中產(chǎn)生靶向變化的堿基編輯器能夠在RNA中誘導(dǎo)廣泛的脫靶效應(yīng)。他們還描述了對堿基編輯器變體進(jìn)行基因改造可顯著降低RNA編輯的發(fā)生 率，這同時也會增加在靶DNA編輯的精確度。相關(guān)研究結(jié)果于2019年4月17日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors”。

為了研究減少或消除不需要的RNA編輯的可能性，論文通訊作者、麻省總醫(yī)院病理學(xué)系的J. Keith Joung博士及其團(tuán)隊篩選了16種具有脫氨酶改造版本的堿基編輯器（即堿基編輯器改造版本），從中鑒定出兩種堿基編輯器改造版本與它們的原始版本同樣高效地誘導(dǎo)在靶DNA編輯，同時誘導(dǎo)顯著少的RNA編輯。實際上，這些SECURE （SElective Curbing of Unwanted RNA Editing, 選擇性抑制不需要的RNA編輯）變體甚至要比未經(jīng)基因改造的脫氨酶更精確地誘導(dǎo)所需的DNA編輯。

Science：開發(fā)出一種檢測CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法---DISCOVER-Seq

Science , 19 April 2019, doi:10.1126/science.aav9023; doi:10.1126/science.aax1827

當(dāng)CRISPR進(jìn)行切割時，DNA會被破壞。因此，為了生存，細(xì)胞將許多不同的DNA修復(fù)因子募集到基因組中的特定位點(diǎn)上以修復(fù)斷裂并將切割末端連接在一起。美國加州大學(xué)伯克利分校的Jacob E. Corn及其團(tuán)隊認(rèn)為如果能夠找到這些DNA修復(fù)因子的位置，就可以鑒定出被CRISPR切割的位點(diǎn)。為此，在一項新的研究中，他們研究了一組不同的DNA修復(fù)因子。他們發(fā)現(xiàn)其中的一種稱為MRE11的DNA修復(fù)因子是DNA切割位點(diǎn)的第一批響應(yīng)者之一。他們利用MRE11開發(fā)了一種名為DISCOVER-Seq的新技術(shù)，它可以識別出CRISPR切割基因組的確切位點(diǎn)。

Corn說，“鑒于我們的方法依賴于細(xì)胞的自然修復(fù)過程來識別切割位點(diǎn)，它經(jīng)證實是一種侵入性更小、更可靠的方法。我們能夠在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、患者細(xì)胞和小鼠中測試我們新開發(fā)的DISCOVER-Seq方法，而且我們的研究結(jié)果表明這種方法可潛在地用于任何系統(tǒng)，而不僅僅是在實驗室中?！?

Cell：首次發(fā)現(xiàn)阻斷CRISPR-Cas9基因組編輯的小分子抑制劑

Cell, 02 May 2019, doi:10.1016/j.cell.2019.04.009

在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所等研究機(jī)構(gòu)的研究人員發(fā)現(xiàn)釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）的首批小分子抑制劑能夠更精確地控制基于CRISPR-Cas9的基因組編輯。具體而言，他們通過開發(fā)一系列高通量生物化學(xué)分析方法和基于細(xì)胞的分析方法，篩選了許多小分子 ，以便鑒定出能夠破壞SpCas9與DNA結(jié)合因而干擾它的DNA切割能力的化合物。這些首批小分子CRISPR-Cas9抑制劑很容易進(jìn)入細(xì)胞，并且比之前發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白小得多。這些新化合物可以對基于SpCas9的編輯技術(shù)進(jìn)行可逆的和劑量依賴性的控制，包括它們在哺乳動物 細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯、堿基編輯和表觀遺傳編輯的應(yīng)用。

論文通訊作者、布羅德研究所的Amit Choudhary說道，“這些技術(shù)為快速鑒定和使用針對SpCas9和下一代CRISPR相關(guān)核酸酶的小分子抑制劑奠定了基礎(chǔ)。靶向CRISPR相關(guān)核酸酶的小分子抑制劑具有廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物醫(yī)學(xué)和國防研究以及生物技術(shù)應(yīng)用的潛力。”

Nature：新型基因編輯工具完成”精準(zhǔn)“編輯

Nature, Published online:12 June 2019, doi:10.1038/s41586-019-1323-z

在最近一項研究中，哥倫比亞大學(xué)的一項新發(fā)現(xiàn)可以解決當(dāng)前基因編輯工具（包括CRISPR）的一個主要缺點(diǎn)，并為基因工程和基因治療提供了一種強(qiáng)有力的新方法。他們的新技術(shù)稱為INTEGRATE，即利用細(xì)菌跳躍基因?qū)⑷魏蜠NA序列準(zhǔn)確地插入基因組而不切割DNA。目前的基因編輯工具依賴于切割DNA，但這些切割可能導(dǎo)致錯誤的發(fā)生。

具體而言，研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子整合到細(xì)菌基因組中的特定位點(diǎn)，而無需切割DNA。重要的是，整合酶插入DNA的位點(diǎn)完全由其相關(guān)的CRISPR系統(tǒng)控制。他們利用這一發(fā)現(xiàn)創(chuàng)建了一種基因編輯工具，經(jīng)編程后可將任何DNA序列插入到細(xì)菌基因組的任何位點(diǎn)。

與CRISPR一樣，整合酶通過向?qū)NA找到合適的位點(diǎn)。通過重編程向?qū)NA，他們能夠精確控制供體DNA整合的位置。通過用其他DNA有效載荷替換轉(zhuǎn)座子序列，它們可以將長達(dá)10000個堿基的序列插入細(xì)菌基因組中。因此，與其他基于整合的編輯工具不同，INTEGRATE技術(shù)是迄今為止研究的首個完全可編程的插入系統(tǒng)。

Science：基因編輯大牛張鋒開發(fā)出新型基因編輯技術(shù)---CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶

Science, Published online:06 June 2019, doi:10.1126/science.aax9181

在一項新的研究中，來自美國麻省理工學(xué)院、布羅德研究所和美國國家衛(wèi)生院（NIH）的研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR相關(guān)的轉(zhuǎn)座子可用于將定制的基因插入到DNA中而不需要切割它。相關(guān)研究結(jié)果于2019年6月6日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases”。在這篇論文中，他們描述了他們的新型基因編輯技術(shù)，以及它在細(xì)菌基因組中進(jìn)行測試時的效果。

近年來，CRISPR基因編輯技術(shù)因它具有治療遺傳性疾病的潛力而備受關(guān)注。不幸的是，盡管已圍繞這種技術(shù)進(jìn)行了大量研究，但它仍然不適合用于人類患者。這是因為這種技術(shù)容易出錯---在切割DNA鏈時，CRISPR有時會脫靶切割，從而導(dǎo)致意料之外的不可預(yù)測的后果（有時會導(dǎo)致癌癥）。

在這項新的研究中，這些研究人員找到了一種方法，即將CRISPR與另一種蛋白結(jié)合使用，對DNA鏈進(jìn)行編輯而不對它進(jìn)行切割---他們稱之為CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座酶（CRISPR-associated transposase, CAST）。他們將一種稱為Tn7的轉(zhuǎn)座子與用于CRISPR中的Cas12酶相結(jié)合在一起，以便對細(xì)菌基因組的一部分進(jìn)行編輯。在實踐中，CRISPR將Tn7轉(zhuǎn)座子引導(dǎo)至基因組中的目標(biāo)位置上---在那里，這種轉(zhuǎn)座子將自身插入基因組中而無需切割它。

Nature：中國科學(xué)院、川大合作新成果！DNA堿基編輯器或能誘導(dǎo)大量脫靶RNA突變！

Nature, Published online:10 June 2019, doi:10.1038/s41586-019-1314-0

近日，一項刊登在國際雜志Nature上的研究報告中，來自中國科學(xué)院和四川大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過研究發(fā)現(xiàn)，DNA堿基編輯器能夠產(chǎn)生成千上萬個脫靶的RNA單核苷酸變異（SNVs），同時通過將點(diǎn)突變引入脫氨酶或能消除這些脫靶的SNVs；本文研究揭示了此前DNA堿基編輯器風(fēng)險中被忽略的一方面，同時研究者通過引入工程化的脫氨酶或有望解決這一問題。

為了消除堿基編輯器的RNA脫靶活性，研究者還分析了引入點(diǎn)突變對APOBEC1和TadA的影響效應(yīng)，他們發(fā)現(xiàn)，三個高保真的變異：BE3W90Y+R126E， BE3 (hA3AR128A) and BE3 (hA3AY130F)能夠在基準(zhǔn)水平上降低RNA脫靶SNVs的水平，同樣地，ABE突變ABE7.10F148A還能夠完全消除脫靶效應(yīng)。

Science：基因編輯大牛張鋒開發(fā)出RESCUE技術(shù)，可擴(kuò)大RNA編輯能力

Science, Published online:11 July 2019, doi:10.1126/science.aax7063

在一項新的研究中，美國麻省理工學(xué)院麥戈文腦科學(xué)硏究所研究員、布羅德研究所核心成員張鋒（Feng Zhang）及其團(tuán)隊如今開發(fā)出一種稱為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange, C→U交換特異性的RNA編輯）的策略。

CRISPR家族酶Cas13在發(fā)揮作用。Cas13（粉紅色）是RESCUE平臺的核心，它使用特定的向?qū)Х肿樱t色）靶向細(xì)胞中的RNA（藍(lán)色）。圖片來自Stephen Dixon。

他們利用一種失活的Cas13將RESCUE引導(dǎo)到RNA轉(zhuǎn)錄本中的目標(biāo)胞嘧啶堿基上，并使用一種新的、經(jīng)過進(jìn)化的、可編程的酶將不想要的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿苷（U），從而指導(dǎo)RNA指令發(fā)生變化。RESCUE顯著地擴(kuò)展了CRISPR工具能夠靶向的范圍，包括蛋白中可修飾的位點(diǎn)，比如磷酸化位點(diǎn)。這些位點(diǎn)充當(dāng)?shù)鞍谆钚缘拈_啟/關(guān)閉開關(guān)，而且主要存在于信號分子和癌癥相關(guān)通路中。

Science：重大突破！CRISPR-Cas系統(tǒng)新用途！開發(fā)出可編程的CRISPR反應(yīng)性智能材料

Science, 23 August 2019, doi:10.1126/science.aaw5122

如今，在一項新的研究中，來自美國哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所和麻省理工學(xué)院的研究人員展示了將CRISPR用作新型刺激反應(yīng)性“智能（smart）”材料的控制元件。一旦被特定的天然的或用戶定義的DNA刺激物激活，一種CRISPR-Cas酶就能夠讓多種智能材料釋放出自身結(jié)合的貨物，比如染料和活性酶，改變它們的結(jié)構(gòu)來部署包埋的納米顆粒和活細(xì)胞，或者調(diào)節(jié)電路從而將生物信號轉(zhuǎn)化為電信號。

論文通訊作者、哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所創(chuàng)始核心學(xué)院成員James Collins博士說，“我們的研究表明CRISPR的力量可以在實驗室之外用于控制DNA反應(yīng)性材料的行為。我們開發(fā)了一系列具有不同能力的材料，這就突顯了可編程的CRISPR反應(yīng)性智能材料（CRISPR-responsive smart material）所支持的應(yīng)用范圍。這些應(yīng)用包括新型治療診斷策略、即時診斷以及對流行病爆發(fā)和環(huán)境危害進(jìn)行的區(qū)域監(jiān)測?！?

Science：全文解讀！開發(fā)出CRISPR LiveFISH技術(shù)，成功對活細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行實時成像

Science, 20 September 2019, doi:10.1126/science.aax7852

在一項新的研究中，來自美國斯坦福大學(xué)、卡斯迪加學(xué)校和中國浙江大學(xué)的研究人員報道了一種稱為CRISPR活細(xì)胞熒光原位雜交（CRISPR live-cell fluorescent in situ hybridization, CRISPR LiveFISH）的實時成像方法，從而允許研究活細(xì)胞中的各種染色體功能。

這些研究人員報道了用于活細(xì)胞DNA和RNA成像的CRISPR LiveFISH技術(shù)?；瘜W(xué)合成的熒光gRNA與dCas蛋白形成的復(fù)合物能夠促進(jìn)快速穩(wěn)健地、可擴(kuò)展地對細(xì)胞（包括原代細(xì)胞）中的基因組DNA進(jìn)行追蹤和對細(xì)胞中的RNA進(jìn)行成像。在富含核糖核酸酶的環(huán)境中，對Cas9:gRNA:DNA三元復(fù)合物中g(shù)RNA的靶DNA依賴性保護(hù)會富集靶信號，同時讓背景噪音最小化。CRISPR LiveFISH也允許對活細(xì)胞中內(nèi)源性基因組位點(diǎn)上發(fā)生的CRISPR誘導(dǎo)的基因編輯和易位事件進(jìn)行動態(tài)追蹤。使用dCas9和dCas13系統(tǒng)的雙DNA/RNA CRISPR LiveFISH能夠?qū)ο嗤?xì)胞中的基因組DNA和RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行實時成像。人們有可能將CRISPR LiveFISH與其他的基因操縱技術(shù)（比如，CRISPRi/a、表觀遺傳修飾和CRISPR-GO）結(jié)合使用來加深對基因組組裝和細(xì)胞核事件的時空動態(tài)變化的理解。

Cell：首次發(fā)現(xiàn)針對III型CRISPR-Cas系統(tǒng)的蛋白抑制劑

Cell, 03 October 2019, doi:10.1016/j.cell.2019.09.003

在一項新的研究中，來自丹麥哥本哈根大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)一種針對III型CRISPR/Cas系統(tǒng)的抑制劑--- AcrIIIB1，它是由硫化葉菌病毒（Sulfolobus virus）SIRV2編碼的。AcrIIIB1僅抑制由輔助蛋白Csx1的RNase活性介導(dǎo)的III-B CRISPR/Cas免疫反應(yīng)。

這些研究人員發(fā)現(xiàn)AcrIIIB1似乎并不結(jié)合Csx1，但是與兩種不同的III-B效應(yīng)復(fù)合物--- Cmr-α和Cmr-γ相互作用。當(dāng)結(jié)合前間隔序列轉(zhuǎn)錄本時，這兩種III-B效應(yīng)復(fù)合物合成環(huán)化寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate, cOA），所產(chǎn)生的cOA激活Csx1的RNase活性。

Nature：新型CRISPR工具或能通過將RNA復(fù)制到基因組中精確修飾基因

Nature, Published online: 21 October 2019, doi:10.1038/s41586-019-1711-4

構(gòu)成生命藍(lán)圖的DNA序列變異對任何物種的健康都是至關(guān)重要的，成千上萬的DNA突變被認(rèn)為都會導(dǎo)致疾病，經(jīng)過幾十年的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究后，如今研究人員在開發(fā)能夠糾正突變的基因組編輯工具上取得了巨大的進(jìn)展，但由于工具依賴于復(fù)雜和相互競爭的細(xì)胞過程，基因編輯的效率和準(zhǔn)確性似乎受到了根本性的限制。

近日，一項刊登在國際雜志Nature上的研究報告中，研究者Anzalone等人描述了一種“查找并替換”（search-and-replace）的基因組編輯技術(shù)，即將兩種分子機(jī)器相結(jié)合來精確改變基因組，該技術(shù)對于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究具有直接且深遠(yuǎn)的影響。

這種名為prime編輯(prime editing)的基因組編輯技術(shù)依賴于一種混合分子機(jī)器，其包括一個改良版本的Cas9，其僅切割兩條DNA鏈中的一條，和一個轉(zhuǎn)錄酶，同時會在切割位點(diǎn)裝載新的和可定制的DNA；這種組合與酵母中自然發(fā)生的過程非常相似，在酵母中，與RNA序列相對應(yīng)的DNA會通過逆轉(zhuǎn)錄酶整合到基因組中去。prime編輯能被一種工程化、由兩部分組成的向?qū)NA（gRNA）進(jìn)行調(diào)節(jié)，gRNA中的“尋找”部分會指導(dǎo)Cas9進(jìn)入到DNA靶點(diǎn)的特殊序列，從而對其中一條DNA鏈進(jìn)行切割，隨后，逆轉(zhuǎn)錄酶會在gRNA的“替換”部分上產(chǎn)生與該序列互補(bǔ)的DNA，并將其裝載在兩個被切割的DNA末端中的一個上，從而取代原來的DNA序列。

此時，被修飾的雙鏈DNA會由兩條不互補(bǔ)的鏈組成，即被編輯過的鏈和未被Cas9切斷的完整鏈，非互補(bǔ)序列在細(xì)胞中是不被容忍的，其中一個鏈必須通過DNA的修復(fù)過程來固定從而匹配另外一個鏈，而完整的鏈則通常會被優(yōu)先保留；因此作者通常必須使用第二種RNA向?qū)碇笇?dǎo)對完整鏈的切割，從而增加修復(fù)該鏈以匹配編輯序列的機(jī)會；研究者通過高效精確地將大量序列引入到DNA中，從而展示了prime編輯的多功能性，比如，研究人員在人類胚胎腎細(xì)胞中使用該技術(shù)來糾正產(chǎn)生血液鐮刀細(xì)胞病的突變，同時還能對引發(fā)神經(jīng)性Tay-Sachs病的突變進(jìn)行編輯，這幾乎完全避免了不完美的編輯，同時研究者還在體外對人類癌細(xì)胞和小鼠神經(jīng)元進(jìn)行了編輯。