瑞德西韋成為在我國(guó)為數(shù)不多的跳過(guò)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，直接進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)的藥物，也是目前唯一一個(gè)Ⅲ期臨床試驗(yàn)的藥物。

武漢病毒學(xué)研究所探究了瑞德西韋對(duì)2019-nCoV的體外抑制活性，結(jié)果表明，作用機(jī)理與其他核苷類(lèi)抗病毒藥物一致，主要作用于病毒進(jìn)入細(xì)胞后期階段；瑞德西韋對(duì)感染2019-nCoV的Vero E6細(xì)胞抑制活性EC50=0.77 μmol·L-1、細(xì)胞毒作用CC50>100 μmol·L-1、選擇性指數(shù)SI>129.87。對(duì)感染細(xì)胞的EC90=1.76 μmol·L-1。

這款被視為人民的希望的藥物到底是怎么研發(fā)出來(lái)的呢？

1、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)

吉利德憑借其在抗病毒類(lèi)藥物研發(fā)領(lǐng)域積累的豐富經(jīng)驗(yàn)和雄厚的技術(shù)實(shí)力，2010年開(kāi)始著手研究抗埃博拉病毒的藥物。

研究人員在P4實(shí)驗(yàn)室篩選了1000多個(gè)核苷類(lèi)化合物對(duì)埃博拉病毒感染的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(EBOV- HMVEC)的抑制活性，發(fā)現(xiàn)衍生物1抑制活性（EC50=0.78 μmol·L-1）最好。

核苷類(lèi)藥物很少在戊糖的1′位進(jìn)行取代，主要原因是其化學(xué)穩(wěn)定性比較差。如1′-甲基鳥(niǎo)苷(2)在pH<7的溶液中N-C苷鍵斷裂，釋放出鳥(niǎo)嘌呤，但是研究發(fā)現(xiàn)，戊糖與核苷以C-C鍵相連時(shí)則穩(wěn)定較好不易斷裂。另有研究顯示，7位氮原子去掉后，得到結(jié)核菌素(3，7-去氮鳥(niǎo)苷)，結(jié)核菌素三磷酸化后是一種RNA依賴(lài)的RNA聚合酶底物，可參入到RNA鏈中，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。但是4-氮雜-7,9-去氮鳥(niǎo)苷(4)細(xì)胞毒性消失而且具有與衍生物3相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性。所以，研究者猜想，以衍生物1為先導(dǎo)化合物，這種C-C鍵連接戊糖和核苷的模式作為抗代謝物具有一定的可行性。

2、結(jié)構(gòu)修飾

2.1 堿基環(huán)修飾

研究者利用甲基、乙烯基和乙炔基取代化合物1的1′-氰基，并測(cè)定了這些化合物對(duì)丙肝病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、流感A病毒、副流感病毒、SARS病毒和柯薩奇病毒的抑制活性和安全性。

表1 4-氮雜-7,9-去氮鳥(niǎo)苷類(lèi)衍生物對(duì)常見(jiàn)病毒的抑制活性

研究者進(jìn)一步探究了化合物1的1′和2′取代基的變化，以及堿基環(huán)的變化對(duì)已感染埃博拉病毒(EBOV)、呼吸道多核體病毒(RSV)和丙肝病毒(HCV)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度EC50，同時(shí)也評(píng)價(jià)了這些化合物對(duì)正常細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度CC50，探究其安全性。

表2 核苷類(lèi)衍生物生物活性和毒性（a是HMVEC細(xì)胞、b是HEp-2細(xì)胞、c是Huh-7細(xì)胞）

從這里可以看出，1′-氰基化合物抗病毒活性好且細(xì)胞毒性小；1′-甲基化合物和1′-乙炔基化合物抗病毒活性消失；1′-氰基-2′-F化合物以及堿基換成鳥(niǎo)嘌呤抗病毒活性均消失。這些結(jié)果表明，化合物1在抗病毒活性和選擇性上都呈現(xiàn)最優(yōu)狀態(tài)。

故研究者直接將化合物進(jìn)行三磷酸化得到衍生物8，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)病毒和人體RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(RdRp)的生物活性。

表3 化合物8對(duì)RSV聚合酶、HCV聚合酶和人類(lèi)聚合酶的抑制作用

注：SNI rate=single nucleotideincorporation rate（單核苷酸結(jié)合速率）

從這里也可以看出，化合物8對(duì)RSV聚合酶和HCV聚合酶具有較好的抑制活性，與化合物1的生物活性吻合。由于此時(shí)，并沒(méi)有從埃博拉病毒中提取出聚合酶，所以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞連續(xù)動(dòng)態(tài)估算出化合物8對(duì)埃博拉病毒聚合酶的抑制活性與丙肝病毒聚合酶抑制活性相當(dāng)（IC50≈5 μmol/L）。另外，化合物8對(duì)人體線粒體聚合酶和RNA/DNA多種聚合酶的抑制活性均較差（IC50>200 μmol/L），且向RNA單鏈中的參入很低，說(shuō)明化合物8對(duì)病毒選擇性高。

2.2 側(cè)鏈修飾

由核苷類(lèi)藥物的抗病毒機(jī)理可知，核苷類(lèi)藥物參入到RNA鏈中抑制病毒復(fù)制，需要經(jīng)過(guò)三磷酸化過(guò)程。其中第一次磷酸化是限速步驟，這一步對(duì)病毒的抑制作用強(qiáng)度影響最大，所以研究者將第一次磷酸化設(shè)定在戊糖的5′-位，既往研究均表明了這種方式的磷酸化有利于第二次磷酸化和第三次磷酸化的發(fā)生，從而發(fā)揮出抗病毒的活性。但是進(jìn)行一次磷酸化后的產(chǎn)物含有兩個(gè)負(fù)電荷，化合物的親水性增強(qiáng)，不利于衍生物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)的傳輸。在研發(fā)抗丙肝藥物索非布韋(9)時(shí)，研究者也遇到了類(lèi)似的困境，但是將其制備成磷酰氨酸酯前藥后，取得了重大突破，故此時(shí)研究者也參照了這種處理方式，制備了相應(yīng)的磷酰氨酸酯前藥，用于掩蔽負(fù)電荷的極性，設(shè)計(jì)合成了一系列化合物，并測(cè)定了衍生物對(duì)易感染埃博拉病毒(EBOV)、呼吸道多核體病毒(RSV)和丙肝病毒(HCV)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度EC50，同時(shí)也評(píng)價(jià)了這些化合物對(duì)正常細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度CC50，作為初步安全性指標(biāo)。

表4 核苷類(lèi)衍生物生物活性和毒性（a是HMVEC細(xì)胞、b是HEp-2細(xì)胞、c是Huh-7細(xì)胞）

從這里可以看出，化合物10對(duì)埃博拉和呼吸道綜合征病毒的抑制活性強(qiáng)11和12，這也與前面的核苷類(lèi)衍生物1和5之間的生物活性差異相符合。衍生物10對(duì)人體正常細(xì)胞的作用很弱，提示有較高的選擇性。值得提及的是11和12對(duì)丙肝病毒的活性顯著強(qiáng)于10，這是因?yàn)?′-甲基取代更有利于與丙肝病毒聚合酶的結(jié)合，索菲布韋的戊糖片段就是2′-CH3-2′-F取代。分子模擬也顯示2′-CH3取代有利于同HCV的結(jié)合，而不利于同EBOV和RSV聚合酶的結(jié)合。

2.3 磷酰氨酸酯修飾

隨后研究者對(duì)磷酰氨酸酯結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。設(shè)計(jì)合成了一系列化合物，并測(cè)定了其生物活性。

表5 磷酰氨酸酯前藥的抗病毒生物活性、半衰期和logD

從這里可以看出，（1）由于磷酰氨酸酯的磷原子為手性中心，前藥10是 1:1的差向異構(gòu)體混合物，經(jīng)分離得到純凈的S和R異構(gòu)體10a和10b，抑制埃博拉病毒的活性EC50均為53 nmol/L，都高于混合物10，原因不詳。后來(lái)選定10a作為候選化合物的原因是具有廣譜抗病毒活性和制備過(guò)程結(jié)晶性較好的緣故；（2）L-Ala換成D-Ala活性顯著降低，提示L構(gòu)型的必要性。L-Ala換成其他氨基酸，例如L-Phe、L-Val和2-氨基異丁酸(AIB)的活性都降低，因而氨基酸片段優(yōu)選為L(zhǎng)-Ala；（3）末端酯基的大小和形狀對(duì)活性有影響，乙基(17)、異丙基(19)、叔丁基(20)和3-戊基(22)活性降低；而環(huán)丁基(18)、環(huán)戊基(21)和新戊基(23)的活性與2-乙基丁基(10)相近。

3、候選藥物確定

10a的藥代動(dòng)力學(xué)研究是在獼猴身上進(jìn)行的，一方面是由于獼猴的病理生理學(xué)與實(shí)際的人類(lèi)疾病相似，另一方面是嚙齒類(lèi)動(dòng)物血漿中含有高表達(dá)的酸酯酶，導(dǎo)致10a快速進(jìn)行血漿代謝。

用獼猴進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，口服給藥后首過(guò)效應(yīng)明顯，生物利用度低，而且感染埃博拉病毒后的患者不宜口服用藥，因此最終選擇靜脈滴注的方式給藥。

獼猴靜注10a后，10a在血液中迅速分解為一磷酸核苷，并且在2h內(nèi)迅速分布在外周血單核細(xì)胞中，最終形成三磷酸核苷(8)發(fā)揮藥效。比如，獼猴靜注10 mg·kg-1的10a后，血漿中8的濃度是體外抑制埃博拉病毒IC50的數(shù)倍，且可維持24 h，半衰期長(zhǎng)達(dá)14 h，故推測(cè)每日給藥一次即可維持有效治療水平。

在I期臨床試驗(yàn)中，對(duì)志愿者進(jìn)行靜脈注射10a后表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，且副作用少，將劑量由150 mg增大到225 mg也未見(jiàn)明顯的不良反應(yīng)，對(duì)成人和嬰兒患者的治療14天后血液和腦脊髓中埃博拉病毒消失。故將10a命名為瑞德西韋(remdecivir)。

在II期臨床試驗(yàn)時(shí)，此時(shí)與瑞德西韋同臺(tái)競(jìng)爭(zhēng)的藥物有三個(gè)。在第一批患者測(cè)試中，瑞德西韋的表現(xiàn)并不佳，53%患者接受治療后死亡，mAb-114、REGN-EB3和Zmapp的死亡率分別為34%、29%和49%。若患者血液中的埃博拉病毒水平不高，使用REGN-EB3后，存活率可高達(dá)94%，mAb114也有89%，ZMapp為76%，但是Remdesivir的存活率僅為67%，從而終止了臨床試驗(yàn)。

至于瑞德西韋是否真能成為人民的希望、2019-nCoVs的克星，還須耐心等待正在進(jìn)行兩項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，但是瑞德西韋在治療埃博拉病毒上的臨床試驗(yàn)至少證實(shí)，安全性較好。

我們期待臨床試驗(yàn)?zāi)軌蛉〉靡粋€(gè)良好的療效?。?！

參考資料

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[2] Discovery and synthesis of a phosphoramidateprodrug of a pyrrolo[2,1-f][triazin-4-amino] adenine C-nucleoside (GS-5734) forthe treatment of Ebola and emerging viruses. J Med Chem, 2017, 60: 1648?1661.

[3] 治療沙粒病毒科和冠狀病毒科病毒感染的方法.