今日，Broad研究所的著名學者張鋒教授和他在Broad研究所，麻省理工學院（MIT）麥戈文腦科學研究所（McGovern Institute for Brain Research）的合作伙伴一起，公布了他們開發(fā)的新一代新冠病毒CRISPR檢測技術的實驗流程。今年2月，張鋒教授和他的合作伙伴曾經(jīng)開發(fā)出一項基于CRISPR的新冠病毒檢測技術，不需要復雜的設備，三步檢測僅需約1個小時，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。

這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術更進一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，并且將檢測新冠病毒所需的化學反應步驟在一個試管中完成。研發(fā)團隊將它命名為STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）。在檢驗12個新冠病毒陽性和5個新冠病毒陰性樣本的實驗中，這一檢測達到100%的特異性和97%的靈敏度。不過科學家們也強調(diào)，這一檢測方法還沒有獲得FDA的批準，尚不能用于臨床上對新冠病毒感染的診斷。

利用CRISPR檢驗新冠病毒的技術原理

目前，診斷新冠病毒感染的主要檢測手段是qPCR，然而，qPCR所需的試劑和設備并不是總是容易獲得，而且樣本通常要運送到中央實驗室中進行檢測，可能延誤對患者的診斷和治療時間。為了推進對疾病的即時（point-of-care）診斷，研究人員力圖使用CRISPR編輯技術開發(fā)簡易、靈敏的分子診斷檢測。張鋒教授團隊在2017年于《科學》雜志上發(fā)表的基于CRISPR的SHERLOCK技術。這個技術與夏洛克·福爾摩斯同名，為“Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing”技術的縮寫。從名字上看，它具有特異的高靈敏度。

SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結合的向導RNA。根據(jù)新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設計了能夠靶向新冠病毒特異性序列的向導RNA。理論上講，只要樣本里有新冠病毒所對應的RNA，向導RNA就能對其進行精準的識別，并激活與其結合的Cas13a蛋白酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會不分青紅皂白，切開所遇到的任何RNA分子。也正是利用這種特性，研究人員們在樣本里還會添加一種通過RNA相連接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會被切斷。這樣一來，通過確認這些分子有沒有被切斷，我們就能知道最初的樣本里有沒有新冠病毒的存在。

后續(xù)的檢測步驟與市場上的懷孕檢測很相似，將反應后的樣本滴在能夠識別“完整分子”和“切斷分子”的試紙上，如果樣本里不存在新冠病毒，那么試紙標識“完整分子”的較低位置上，就會出現(xiàn)一條條帶；相反，如果樣本里真的有新冠病毒對應的RNA，那么在代表“切斷分子”的較高位置上，會出現(xiàn)另一條條帶。通過條帶位置的不同，我們很容易就能確認新冠病毒的存在與否。

▲通過條帶的不同位置，我們可以判斷有沒有新冠病毒的存在（圖片來源：參考資料[5]）

張鋒教授和他的合作伙伴在今年2月發(fā)布的新冠病毒檢測技術就是基于這一原理。隨后，加州舊金山大學（UCSF）的Charles Chiu教授與Mammoth Biosciences公司的聯(lián)合研究團隊，以及阿根廷的布宜諾斯艾利斯大學和CASPR Biotech的聯(lián)合研究團隊也開發(fā)了基于Cas12的新冠病毒CRISPR檢測技術。然而，這些基于CRISPR的新冠病毒檢測都需要兩個反應步驟，第一個步驟是使用等溫擴增（isothermal amplification）反應擴增RNA的數(shù)量，然后將擴增的樣本加入到包含Cas酶和其它反應試劑的試管中進行檢測反應。這不但增加了檢測流程的復雜性，而且更多的樣本轉移步驟可能帶來的污染。

將等溫擴增和Cas酶反應合二為一的STOPCovid檢測

因此，張鋒教授和他的合作伙伴致力于開發(fā)一種更為簡便的檢測手段，讓擴增RNA數(shù)目的等溫擴增步驟和Cas酶檢測的化學反應能夠在同一個試管中進行。為此，他們選擇了環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）作為擴增RNA的方法。這一選擇也有其實用方面的原因，因為LAMP所需的試劑并不難于獲取。

然而LAMP反應需要在溫度為60℃的反應條件下進行，而Cas13a在這一溫度下不夠穩(wěn)定。研究人員找到了名為AapCas12b的Cas酶，能夠在LAMP反應條件下維持足夠的活性，同時對指導RNA和反應中的添加劑進行了優(yōu)化，讓Cas酶介導的檢測步驟維持足夠的靈敏度。在實驗條件下，這一檢測的下限為100個新冠病毒RNA分子。

研究人員同時簡化了提取RNA的步驟，只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液樣本中加入裂解病毒，釋放RNA的試劑，無需純化分離RNA，就可以將釋放的病毒RNA用于檢測。

▲STOPCovid檢測的測試流程（圖片來源：參考資料[3])

STOPCovid在檢測患者樣本時表現(xiàn)出100%特異性

在今年2月發(fā)布的研究中，由于患者樣本的稀缺，研究人員只使用合成的RNA對新冠病毒CRISPR檢測的表現(xiàn)進行了評估。這次，研究人員使用12個新冠病毒陽性和5個新冠病毒陰性患者咽拭子樣本對STOPCovid檢測的特異性和靈敏度進行了檢驗。每個樣本都進行了三重測試（triplicate）。實驗結果表明，在5個新冠病毒陰性的樣本中，STOPCovid沒有給出任何假陽性結果，而在12個新冠病毒陽性樣本中，STOPCovid在11個樣本的三次測試中都給出陽性結果，在1個樣本的三次測試中兩次給出陽性結果。

▲STOPCovid檢測結果（圖片來源：參考資料[2]）

研究人員表示，他們已經(jīng)準備了一些初始試劑盒，能夠讓其它的研究人員進一步開發(fā)這一檢測平臺。研究團隊已經(jīng)與美國FDA進行交流，探索獲得緊急使用授權（EUA）所需要的步驟。張鋒教授在訪談中表示，這一檢測的獨特之處在于將化學反應簡化為一個步驟，從而防治在多步反應中因為轉移液體可能帶來的樣本污染。這使它更適合作為即使檢測使用。

參考資料：

[1] New CRISPR-based test for Covid-19 could be a simple, cheap at-home diagnostic, scientists say. Retrieved May 5, 2020, from https://www.statnews.com/2020/05/05/crispr-covid-19-test-could-be-simple-cheap-at-home-diagnostic/

[2] STOPCOVID. Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/

[3] Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/docs/STOPCovid%20Whitepaper.pdf

[4] Broughton et al., (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4.

[5] A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Retrieved February 14, 2020, from https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf