什么是PPI（protein?protein interaction）？答：PPI又稱作蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，通常是細胞間通訊的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這些相互作用的失調(diào)通常會導(dǎo)致疾病（例如癌癥）的發(fā)生。因此通過調(diào)節(jié)這些相互作用位點有利于探索疾病治療的新方法。目前，大部分研究主要以在生理條件下自然形成的蛋白間相互作用（native protein?protein interaction）作為藥物開發(fā)靶標，而對于調(diào)控非天然蛋白間相互作用靶點（non-native protein?protein interaction）的研究則鮮有報道[1, 2]。

研究亮點

近日，來自臺灣國立中興大學(xué)的候明宏團隊解析了MERS-CoV N-NTD（中東呼吸綜合征冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然二聚體晶體構(gòu)型，并以其非天然蛋白間的接觸界面作為篩選的靶點，從Acros和ZINC藥物數(shù)據(jù)庫中篩選出具有抗冠狀病毒作用的先導(dǎo)化合物 P3 (5-芐基氧代精氨酸)。該工作發(fā)表于Journal of Medcine Chemistry上[1]。

圖1：參考文獻1截圖

研究思路

中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）將其基因組包裝在核衣殼（N）蛋白中，形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體。RNP對于病毒的轉(zhuǎn)錄和組裝至關(guān)重要。因此，通過小分子調(diào)節(jié)MERS-CoV核衣殼（N）蛋白寡聚來破壞病毒核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體的形成是一種可行的抗病毒藥物開發(fā)策略。MERS-CoV核衣殼（N）蛋白包含N末端域（NTD）和C末端域（CTD），這兩個域都會參與RNA結(jié)合。MERS-CoV N-NTD結(jié)構(gòu)（核衣殼（N）蛋白中的N末端域）以單體構(gòu)型折疊。而MERS-CoVN-CTD（核衣殼（N）蛋白中的C末端域）則始終是天然二聚體，并通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致核衣殼（N）蛋白寡聚?？偟膩碚f，這個工作的設(shè)計思路就是利用MERS-CoV N-CTD天然的蛋白間相互作用的特點使單體的MERS-CoVN-NTD互相靠近，從而形成非天然的蛋白與蛋白間作用位點，然后以此位點作為抗病毒藥物設(shè)計的靶點。

圖2：抗冠狀病毒藥物設(shè)計策略。圖片來源于參考文獻1

非天然二聚體界面的晶體結(jié)構(gòu)解析

為了進一步了解該靶點的具體特點以及篩選抑制劑，該團隊首先解析了MERS-CoV N-NTD非天然蛋白間作用位點的晶體結(jié)構(gòu)。作者將相互作用的MERSCoV N-NTD蛋白二聚體命名為單體1和2，再將二聚體界面分為兩個區(qū)域：一個位于N末端柔性區(qū)，另一個位于N蛋白的β4和β5之間的環(huán)上。在第一個區(qū)域中，單體1的W43，N66，N68，Y102和F135產(chǎn)生了一個保守的疏水口袋，而單體2的M38的側(cè)鏈則能通過疏水接觸進入單體1的疏水口袋。此外，單體2的H37和N39則分別與單體1的W43和F135堆積，并有助于界面疏水作用。單體2與單體1之間的氫鍵作用則主要包括N39的側(cè)鏈與N68主鏈形成氫鍵，以及殘基G104，F(xiàn)135和T137的主鏈氧與Q73和T134的側(cè)鏈形成三個氫鍵。在進一步的研究中，該團隊發(fā)現(xiàn)二聚體狀態(tài)是否穩(wěn)定，需要通過單體2上的殘基H37，M38來維持二聚體狀態(tài)。此外，如果W43A突變會顯著降低了N-NTD的寡聚趨勢。還有一個重要的特點就是該二聚體界面具有疏水性。在這里，筆者不禁想說的是，對于藥物的設(shè)計，靶點結(jié)構(gòu)的解析往往至關(guān)重要，能夠讓我們更加有目標和方向。就如同生病吃藥，必須對癥下藥，才能藥到病除。從晶體結(jié)構(gòu)我們可以了解到靶點的活性位點、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、相互作用的位置等等，對接下來的全新藥物設(shè)計具有很好的指導(dǎo)意義。

圖3：MERS-CoV N-NTD的非天然二聚體界面結(jié)構(gòu)。圖片來源于參考文獻1

先導(dǎo)化合物的篩選策略

那么，對非天然二聚體界面相互作用的解析以及界面的疏水性對于接下來先導(dǎo)化合物的篩選應(yīng)該給予什么啟發(fā)？而且該團隊又是怎樣設(shè)計篩選策略的呢？

首先依據(jù)對非天然二聚體界面相互作用位點的解析結(jié)果，該研究團隊從模板中除去了H37和M38，以鑒定可以替代載體融合殘基的化合物，并以N-NTD二聚體界面的疏水口袋中的W43進行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，初步篩選到了系列的配體。經(jīng)筆者的分析，采用這個策略的主要原因是W43會影響MERS-Cov N-NTD蛋白的寡聚，以及H37和M38是維持二聚體界面穩(wěn)定的主要殘基。

然后基于非天然二聚體界面的疏水性的性質(zhì)，該團隊以所獲得的配體N-NTD之間的疏水互補性（SL/L）和低拓撲極性表面積（TPSA）為標準，虛擬篩選出三個候選化合物：芐基-2-（羥甲基）-1二氫吲哚羧酸酯（P1），臨床藥物依托度酸（P2）和5-芐氧基谷氨酰胺（P3）。相較于化合物P1和P2，5-芐氧基谷氨酰胺（P3）具有較高的親脂性匹配表面（SL/L）、對接分數(shù)（Socre）以及較低的拓撲極性表面積（TPSA），并能增加蛋白質(zhì)色氨酸周圍的微環(huán)境的剛性、疏水性以及穩(wěn)定MERS-CoVN-NTD二聚體結(jié)構(gòu)。重要的是，細胞毒性濃度（CC50=805.32μM）和有效濃度（EC50=32.1μM）實驗結(jié)果也表明P3具有良好的治療指數(shù)。因此，P3是極好的抗MERS-CoV候選抑制劑。

圖4：候選化合物P1, P2及P3的結(jié)構(gòu)式

P3誘導(dǎo)MERS-CoVN蛋白聚集

在篩選出最優(yōu)的先導(dǎo)化合物P3后，接下來該團隊首先要證明的問題就是該化合物是不是同預(yù)期設(shè)計的策略一樣，能不能誘導(dǎo)冠狀病毒N蛋白聚集？

該團隊使用小角X射線散射（Small Angle X-Ray Scattering，SAXS）研究了P3對全長MERSCoV N蛋白結(jié)構(gòu)的影響。全長MERS-CoV N蛋白與先導(dǎo)化合物P3結(jié)合后，會形成大的蛋白聚集體，并通過聚集體中的N-CTD（核衣殼（N）蛋白中的C末端域）自然形成拓撲封閉的八聚體，從而誘導(dǎo)N蛋白聚集而抑制MERS-CoV RNP（中東呼吸綜合征冠狀病毒核糖核蛋白復(fù)合體）的形成。

圖5：與化合物P3結(jié)合后的蛋白聚集體。圖片來源于參考文獻1

抗病毒活性研究

進一步的細胞實驗表明50μM的P3在48小時后對病毒滴度（病毒的毒力，單位體積內(nèi)活病毒具有功能的病毒的量）的影響很小，但能明顯抑制病毒RNA的復(fù)制。而100μM的P3在48小時后則完全抑制了病毒的產(chǎn)生和復(fù)制。另外，免疫熒光結(jié)果也表明了化合物P3可通過誘導(dǎo)細胞內(nèi)核衣殼（N）蛋白的異常聚集而抑制MERS-CoV活性。

圖6：化合物P3的抗病毒活性研究。圖片來源于參考文獻1

對抗SARS-Cov-2抑制劑設(shè)計的啟示

來自中國科學(xué)院等機構(gòu)的研究人員近日在Cell期刊上（Cell,2020, doi:10.1016/j.cell.2020.03.045）發(fā)表的研究成果表明MERS-Co和SARS-CoV-2蛋白的結(jié)構(gòu)特征相一致[3]。此外，他們也發(fā)現(xiàn)SARS-CoV S表面的刺突糖蛋白（S蛋白）同MERS-CoV一樣都會被宿主蛋白酶切割為分別負責(zé)受體識別和膜融合的S1和S2亞基。而S1可以進一步分為核衣殼（N）蛋白中的N末端結(jié)構(gòu)域（N-NTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（N-CTD），其SARS-Cov-2的基因組則包裝在核衣殼（N）蛋白中，形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體。這是不是給了我們些許提示，是不是可以同樣以SARS-Cov-2N-NTD（新型冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然蛋白間的接觸界面為靶點篩選出在細胞水平上誘導(dǎo)異常的全長N蛋白寡聚以及具有抗新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）作用的小分子化合物。當(dāng)然，我們也必須要更加具體分析SARS-Cov-2N-NTD（新型冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然蛋白間作用界面的特點。因為新冠病毒SARS-Cov-2的基因和特征雖然和MERS-Cov有很高的相似，但是些許的變化，都會造成其與人體的宿主細胞結(jié)合能力、傳染能力、致病能力發(fā)生翻天覆地的變化，從而嚴重危害成千上萬人的身體健康。

結(jié)語

在全球新冠肺炎疫情如此嚴峻的今天，全新的抗冠狀病毒藥物設(shè)計策略對目前正在肆掠和未來的冠狀病毒治療具有重要意義。目前，靶向冠狀病毒的藥物主要為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）、RNA聚合酶、病毒蛋白酶以及病毒3CL水解酶，而以冠狀病毒的非天然蛋白間相互作用界面（non-native protein?protein interaction）作為抗病毒抑制劑篩選靶點是一次新的突破。

相關(guān)參考文獻

[1] Lin Shanmeng etal. Structure-Based Stabilization of Non-native Protein?Protein

Interactions of Coronavirus Nucleocapsid Proteins in Antiviral Drug Design. Journal of

MedicineChemistry.

[2] Jürgen Bosch. PPIinhibitor and stabilizer development in human diseases. DrugDiscovery Today:Technologies.

[3] Wang Qihui et al. Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human

ACE2. Cell.