來源：醫(yī)藥魔方Pro

PROTACs全稱為Proteolysis-Targeting Chimeras，即蛋白水解靶向嵌合體，是一種不同于抗體和傳統(tǒng)小分子抑制劑的新藥物類型，由3部分組成：靶蛋白binder、linker以及E3泛素連接酶binder。也就是說，PROTAC分子的一端與靶蛋白結(jié)合，另一端與E3泛素連接酶結(jié)合。而E3泛素連接酶可通過將一種叫做泛素的小蛋白貼在靶蛋白上將其標(biāo)記為缺陷或受損蛋白。之后，細(xì)胞的蛋白粉碎機(jī)（即，蛋白酶體）會識別和降解被標(biāo)記的靶蛋白。

近幾年，作為調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)態(tài)的一種新方式，PROTAC受到了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛關(guān)注，很多團(tuán)隊(duì)正在積極開發(fā)基于PROTAC技術(shù)的蛋白降解劑。靶蛋白方面，有統(tǒng)計(jì)稱，目前PROTAC針對的熱門靶點(diǎn)有100多個(gè)，進(jìn)展最快的包括AR-PROTAC、ER-PROTAC、BTK-PROTAC等；E3泛素連接酶方面，目前最常被用于PROTAC開發(fā)的有兩種，分別是Von Hippel Lindau (VHL)和cereblon (CRBN)。其中，CRBN也是另一類在研蛋白降解劑——分子膠經(jīng)過驗(yàn)證的靶點(diǎn)。

CRBN是CRL4 E3泛素連接酶的一部分，作為底物受體（substrate receptor, SRs）識別底物蛋白，從而啟動降解過程。CRLs是E3泛素連接酶中最大的一個(gè)家族，通過將底物受體和適配器蛋白圍繞不同的cullin骨架進(jìn)行組裝，形成了超過250種CRLs。

簡單來說，分子膠降解劑是一類可誘導(dǎo)E3泛素連接酶底物受體（如CRBN）與靶蛋白之間新型相互作用，從而導(dǎo)致靶蛋白降解的小分子。沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺類小分子免疫調(diào)節(jié)劑是分子膠的一個(gè)顯著例子，可重定向CRBN，從而使轉(zhuǎn)錄因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，導(dǎo)致IKZF1和IKZF3被蛋白酶體降解。類似地，抗癌磺胺類藥物indisulam也可引導(dǎo)E3泛素連接酶DCAF15與RBM39之間的相互作用，促進(jìn)RBM39的降解。總之，分子膠以及PROTAC技術(shù)的發(fā)展為靶向致病蛋白，包括許多利用傳統(tǒng)的方法很難靶向的蛋白，提供了新策略。

4月4日，來自威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的一個(gè)科學(xué)家小組在發(fā)表于European Journal of Medicinal Chemistry雜志上的一篇論文中公布了他們所開發(fā)的一款新型MDM2降解劑[1]。

MDM2，全稱為雙微體同源基因2（mouse double minute 2），是p53（一種強(qiáng)大的腫瘤抑制因子，人類癌癥中突變最頻繁的基因）的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，在腫瘤中高表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到重要的作用。先前的研究表明，MDM2不僅可與p53結(jié)合，以阻斷其腫瘤抑制反式激活域，該蛋白本身還是一種E3連接酶，可標(biāo)記p53，使其被蛋白酶體降解。由于約50%的人類癌癥中保留著野生型p53基因，只是這些p53的腫瘤抑制功能被MDM2等信號分子削弱了，因此研究者們希望，通過開發(fā)小分子抑制劑或降解劑來阻斷p53與MDM2之間的相互作用，攜帶野生型p53的患者能夠恢復(fù)p53的抑癌活性。

在2019年8月，該科學(xué)家團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道，他們開發(fā)了一款高效的MDM2-PROTAC——WB156[2]，WB156由nutlin衍生物和CRBN配體來那度胺連接而成（下圖A；nutlin是最早被發(fā)現(xiàn)可以抑制p53–MDM2相互作用的小分子抑制劑）。在白血病細(xì)胞中，WB156能夠有效耗盡MDM2，激活野生型p53，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。不過，盡管WB156能夠有效降解MDM2，誘導(dǎo)p53激活，顯示抗增殖作用，但該分子只能在有限數(shù)量的白血病細(xì)胞系中起作用。

MDM2降解劑的設(shè)計(jì)。(A)MDM2降解劑WB156的結(jié)構(gòu)、Ugi反應(yīng)ligand1和ligand2；(B) Ugi配體與MDM2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)；(C)從Ugi反應(yīng)衍生配體和來那度胺衍生物構(gòu)建MDM2降解劑的策略。（來源：European Journal of Medicinal Chemistry）

為了克服這一瓶頸，科學(xué)家們設(shè)想，融合不同的MDM2配體可能能夠使MDM2降解劑在更廣泛的癌癥中起作用。在最新發(fā)表的這項(xiàng)新研究中，他們首先利用“MDM2 ligand 1”和“MDM2 ligand 2”（上圖A）進(jìn)行四組分Ugi反應(yīng)制備了用于開發(fā)MDM2降解劑的配體，然后用這些配體作為MDM2的binder來構(gòu)建活性MDM2降解劑。經(jīng)過廣泛的優(yōu)化，WB214被鑒定為在各種白血病細(xì)胞系中最有效的抗增殖藥物。

令人驚訝的是，機(jī)制研究表明，這種新型WB214降解劑并沒有激活p53，相反的，WB214誘導(dǎo)了p53的降解，這與該團(tuán)隊(duì)先前報(bào)道的MDM2降解劑WB156完全相反。

科學(xué)家們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)來調(diào)查導(dǎo)致這種效應(yīng)背后的潛在作用機(jī)制。結(jié)果顯示，1)WB214介導(dǎo)的MDM2-p53復(fù)合物降解是通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的；2) p53在MDM2降解過程中是一個(gè)旁觀者，因?yàn)樗cMDM2直接相關(guān)，因此產(chǎn)生了“旁觀者降解效應(yīng)”；3) WB214-CRBN復(fù)合物不在p53結(jié)合位點(diǎn)與MDM2結(jié)合（相比之下，MDM2 ligand 1或WB13均在p53結(jié)合位點(diǎn)與MDM2結(jié)合）。

由于三元復(fù)合物的形成是蛋白酶體降解的前提，因此，研究者們進(jìn)一步分析了WB214誘導(dǎo)三元復(fù)合物形成的情況，并證實(shí)WB214能夠以劑量依賴性的方式有效誘導(dǎo)三元復(fù)合物的形成，且相比WB156，WB214誘導(dǎo)了更強(qiáng)的CRBN-MDM2相互作用(下圖D)。這些數(shù)據(jù)表明，與WB156(真正的MDM2 PROTAC)不同，WB214并不是通過經(jīng)典的PROTAC機(jī)制降解MDM2。WB214的作用機(jī)制與分子膠更一致。換句話說，WB214只是通過與其CRBN相互作用導(dǎo)致與MDM2結(jié)合。作者們稱，這是首次發(fā)現(xiàn)MDM2可以作為CRBN的新底物（neo-substrate）。

接著，研究揭示，WB214降解p53后依然能夠抑制白血病細(xì)胞生長是因?yàn)椋@款降解劑還能夠有效降解GSPT1。GSPT1全稱為G1 to S phase transition 1，也被稱為eRF3a，通過與釋放因子eRF1相互作用，介導(dǎo)終止密碼子識別和新生蛋白從核糖體釋放。先前有研究顯示，GSPT1作為CRBN的新底物（neo-substrate），可被CC-885或ZXH1-161(來那度胺衍生物)有效降解，導(dǎo)致白血病細(xì)胞增殖被顯著抑制。也有報(bào)道稱，GSPT1是招募CRBN的PTOTAC分子產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的一種原因，例如Crews教授及其同事發(fā)現(xiàn)，基于沙利度胺的c-Met PROTAC分子誘導(dǎo)GSPT1降解。此外，也有團(tuán)隊(duì)通過對MDM2 PROTAC分子的簡單結(jié)構(gòu)修飾意外發(fā)現(xiàn)了可降解GSPT1的分子膠（MG-227）。MG-227僅顯示中度MDM2降解作用，但具有非p53依賴性的高效細(xì)胞生長抑制作用，最終研究確定MG-227的靶點(diǎn)為GSPT1。綜合這些先前的研究不難看出，GSPT1是CRBN常見的新底物，它對抑制細(xì)胞增殖有重要作用。

因此，在這項(xiàng)研究中，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校的科學(xué)家們也檢測了WB214是否也降解了GSPT1。結(jié)果顯示，相比MDM2和p53，WB214對GSPT1的降解作用最強(qiáng)，能夠以劑量依賴的方式消耗GSPT1。

白血病細(xì)胞降解特征（Western blot分析）。(A)細(xì)胞用DMSO或指定化合物處理6小時(shí)后MDM2、p53 和GSPT1的免疫印跡分析；(B) 細(xì)胞用DMSO或指定濃度WB214處理12小時(shí)后 GSPT1的免疫印跡分析。（來源：European Journal of Medicinal Chemistry）

最后，科學(xué)家們嘗試開發(fā)MDM2或GSPT1選擇性降解劑，通過改變WB214的不同基序，他們發(fā)現(xiàn)，盡管效力較弱，但“化合物36（compound 36）”能夠選擇性降解GSPT1。研究者們表示，接下來，他們將開展進(jìn)一步研究，提高GSPT1選擇性降解劑的效力，同時(shí)開發(fā)優(yōu)先降解MDM2的化合物。

在論文的討論部分，作者們指出，這項(xiàng)工作給他們帶來的一個(gè)很重要的教訓(xùn)是，在開發(fā)蛋白降解劑時(shí)，與靶蛋白（如MDM2）結(jié)合的蛋白質(zhì)（如p53）也可能作為“旁觀者”被降解。迄今為止報(bào)道的大多數(shù)新底物都是CRBN的，而隨著被用于開發(fā)蛋白降解劑的E3泛素連接酶家族變得更加壯大，脫靶效應(yīng)可能發(fā)生得更多。

參考資料：

[1] BoWang et al. Development of MDM2 degraders based on ligands derived from Ugi reactions: Lessons and discoveries.European Journal of Medicinal Chemistry(2021).

[2] BoWang et al. Development of selective small molecule MDM2 degraders based on nutlin. European Journal of Medicinal Chemistry(2019).